菌種鑑定分析介紹

 

為何需要進行菌種鑑定?

  • 微生物污染來源的確認
  • 產品添加菌的品質檢驗
  • 標準菌株品管

 

微生物污染來源的確認:

食品、藥品、化粧品、飲用水、醫藥器材、生物製劑等與人體生理安全相關之產品,進入各大銷售通路前,需確保產品為無菌或含菌量低於相關法規標準值。產品若遭受微生物污染,導致品質腐敗,增加消費者的安全風險,則除了產品經濟價值的損失外,更會影響消費者的信心,對公司品牌也會受損。

因此,在產品生產過程中如何降低微生物汙染尤為重要,各生產環節中均可能發生微生物汙染,如:原物料、機械設備、操作人員、生產與儲存空間等,若能即時鑑定汙染菌種,並提出有效預防汙染的計畫,便能降低損失。

 

產品添加菌的品質檢驗:

近年來,由於益生菌的臨床效果逐漸被證實,市面上出現許多食品、醫藥、保健食品等產品皆標榜其中添加多種益生菌,然而部份產品經過抽驗後,發現實際上菌種、菌數含量與標示不符合之情況,雖不置消費者於安全風險之中,但產品與公司容易給消費者留下負面形象,因此產品自我把關非常重要,先行確認自身產品中益生菌實際保有活性之菌種菌量,並委託第三方公正機構進行指定菌種檢驗,不僅提升消費者的信心,亦能建立良好的品牌形象。

 

標準菌株品管:

此外,菌種鑑定亦能應用於實驗、研究所使用之標準菌株,進行實驗前預先確認標準菌株正確無誤,避免菌株因污染或保存失當,使實驗失敗導致經濟損失與實驗結果可信度降低。

 

 

菌種鑑定之方法

菌種鑑定依檢體類型各有其適合的處理方法,前處理後所分離之菌落依菌落型態與染色鏡檢結果初步分類為細菌、酵母菌與絲狀真菌,並選擇適當之鑑定方式,實驗室目前主要使用之鑑定方法為 MALDI-TOF MS 鑑定分析,並視情況使用生化套組或分子生物法定序輔助分析,詳如表 1 及表 2 。

 

基質輔助雷射脫附游離飛行時間式質譜儀 (MALDI-TOF MS)

Matrix-Assisted Laser Desorption / Ionization Time-of-Flight Mass-Spectrometry

為一種新興的菌種鑑定技術,鑑定原理為全細胞蛋白質質譜指紋分析,並與 MALDI Biotyper 資料庫中已知菌種的全蛋白質譜訊號做比對,快速鑑定未知菌種的身份,該鑑定方法具有多項優點,台美特別斥資導入並應用於菌種鑑定服務:

  • 單一的新鮮菌落即可進行分析,且每一樣品盤最多可上 94 個樣品點,具高通量分析鑑定的效果。
  • 內建為微生物資料庫含超過 5000 多筆菌株標準質譜可供比對,並可自行擴建質譜指紋比對資料庫。
  • 已獲得台灣 TFDA 及歐盟、美國 FDA 之體外醫療檢測 (IVD) 驗證。
  • 在食品工業方法研究所生物資源保存及研究中心 (Bioresource Collection and Research Center,BCRC) 及國際知名菌種中心(如美國 ATCC、德國 DSM、 日本 NBRC、荷蘭 CBS 等)廣泛使用於微生物品管、分類鑑定和大量菌株之快速篩選。
  • 比對分析後所獲得的結果前一、二名若為相同菌種學名,且皆大於一定分數 (2.0) 則可認定為該未知菌種之身份。

MALDI-TOF MS 固然便利,但仍有諸多菌種,如:絲狀真菌或尚未建立標準菌株質譜指紋的細菌,無法經由該鑑定方法確認其菌種所屬,亦無法鑑別全蛋白質質譜相似之菌種,如:Bacillus cereus group,因此分子生物法定序或生化試驗的輔助仍不可或缺。

 

分子生物方法

抽取未知菌種的 DNA,經聚合酶連鎖反應儀器增幅後定序,將獲得的核酸序列與 National Center for Biotechnology Information (NCBI) 資料庫進行比對分析,以鑑定菌種身份。亦可使用特定菌株之專一性引子探針進行 Real-time PCR 檢驗個別菌株,確認產品內是否存有指定菌株。

 

生化特性試驗:

依照微生物生長代謝需求與產物的不同來確認菌種的身份,如:不同碳氮源的利用、是否具有溶血特性、芽孢生成生否或特定酵素有無等等特性。依細菌細胞壁染色特性與型態的差別可分成革蘭氏陽性桿菌、球菌與陰性桿菌、球菌等類別,在生化試驗項目的選擇上也不同,如:革蘭氏陽性球菌的觸酶與凝固酶測試、陰性桿菌的 IMViC 或生化八管。

除了傳統的生化試驗外,市面上亦有能快速進行生化試驗的鑑定套組,本公司所使用之快速套組 有 API 20E、API 50 CHB、API 50 CHL 與 Remel RapID™ 快速生化鑑定。

API 20E 鑑定套組含 20 小管,可進行 23 種生化試驗,適用於腸道桿菌或其他革蘭氏陰性桿菌之鑑定;API 50 CHB 與 CHL 則含有 49 種不同碳水化合物,分別用來快速鑑定芽孢桿菌屬與乳酸菌;Remel RapID™ 為目前最完備之生化鑑定套組之一,可鑑定多達 400 多種微生物。不同於傳統生化試驗的繁雜測項選取與操作,快速的生化鑑定套組能夠在相對較短的時間內完成生化試驗,加快菌種鑑定的效率。

 

 

 

表一、不同檢體類型之鑑定方法選用

項目檢體類型鑑定方法備註
未知菌種鑑定1. 平板培養基
2. 污染樣品
3. 添加菌株之完整產品
1. 生化試驗
2. MALDI-TOF MS
3. PCR增幅定序
1. 一般環境菌種鑑定
2. 污染源鑑定
3. 針對產品中未指定菌株,以MALDI-TOF MS滿盤方式檢測
指定菌株鑑定1. 添加菌株之完整產品
2. 複合性乳酸菌產品
1. 生化試驗
2. MALDI-TOF MS
3. PCR增幅定序
4. Real-Time PCR
1. 產品中指定菌株鑑定
2. 複合性乳酸菌產品以Real-time PCR菌株專一性引子進行個別鑑定

表二、常見菌種鑑定方法比較

鑑定方法

細菌分離培養
與生化鑑定

MALDI-TOF MS

分子生物法鑑定

適用菌種細菌、酵母菌細菌、酵母菌細菌、真菌
鑑定流程增殖培養

分離純化

生化試驗
增殖培養

分離純化

蛋白質萃取鑑定
核酸萃取與增幅 (PCR)

定序確認菌種

菌株專一性引子探針
(個別鑑定)
儀器與試劑培養基、生化試管、
快速鑑定套組
MALDI-TOF MS核酸萃取套組
聚合酶連鎖反應儀器
工作天數5-10天2-3天5-7天*
備註檢體需含有活菌檢體需含有活菌無活性菌株
亦可進行鑑定
*備註:由於真菌培養時間較長,因此實際所須工作天數可能會更長。

 

 



推薦閱讀: